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基因敲除細胞系(KO)
立即咨詢天博克羅地亞官網(wǎng)依托成熟的AI-CRISPR?細胞基因編輯平臺和完善的細胞培養(yǎng)體系，啟動近5萬個全基因組敲除細胞庫構(gòu)建計劃，致力于為基礎(chǔ)研究、抗體驗證、藥物篩選、疾病診斷、治療和檢測等方面提供大力支持。KO細胞庫涵蓋腫瘤、心血管、神經(jīng)等20多種研究領(lǐng)域，現(xiàn)在下單現(xiàn)貨KO細胞庫，交付單克隆純合子，快至1周發(fā)貨，低至6880元，點擊圖片即可了解活動詳情。
一、KO細胞敲除定制服務(wù)
作為實現(xiàn)基因功能缺失的重要調(diào)控方式，基因敲除（Knock out, KO）可完全消除目的基因的表達，使其蛋白完全不表達或功能徹底喪失，且可以更好地觀察細胞表型的變化。但KO細胞株構(gòu)建過程較為繁瑣，實驗周期長，且容易出現(xiàn)敲除效果不徹底的情況，導(dǎo)致研究進度受阻。
基于AI-CRISPR?細胞基因編輯系統(tǒng)，現(xiàn)在定制KO細胞服務(wù)，交付單克隆純合子，快至30個工作日，低至10980元，滿足您的早期篩選實驗需求 。我們使用優(yōu)化的轉(zhuǎn)染體系將RNP（gRNA和Cas蛋白復(fù)合物）直接遞送到細胞內(nèi)，相比于質(zhì)：筒《鏡菴RISPR/Cas介導(dǎo)的方法，脫靶效率降低明顯，能更精準地切割目標DNA序列。
基因敲除細胞服務(wù)詳情，超300種細胞成功案例！
| 細胞類型 | 常規(guī)細胞系、腫瘤細胞系、IPS/ES等各類細胞 |
|---|---|
| 服務(wù)類型 | 單基因/多基因敲除 |
| 交付成果 | 純合子克隆 |
| 周期/價格 | 快至6周，低至10980元；添加官方微信號：18520176000（手機同號） |
二、基因敲除細胞方案
天博克羅地亞官網(wǎng)擁有多種敲除策略滿足客戶需求：我們具備移碼突變、片段敲除、多基因敲除等編輯技術(shù)能力，根據(jù)研究項目的基因和細胞信息的不同，采取最佳方案，極大提高目的基因敲除的成功率和蛋白的不表達效率。
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三、服務(wù)流程及質(zhì)量控制
優(yōu)化實驗流程，有效提升編輯效率
基因/細胞分析→sgRNA設(shè)計與合成→細胞電轉(zhuǎn)及KO效果鑒定→單克隆化→測序分析→復(fù)檢及擴增。
強大的算法賦能細胞的基因編輯項目——AI輔助篩選Western Blot陰性單克隆。
借助罕見病數(shù)據(jù)中心（RDDC）開發(fā)的RNA剪接模型工具，預(yù)測堿基序列突變后mRNA序列可能發(fā)生的剪切情況，輔助篩選ORF移碼的單克。玫毓姹茉赪estern Blot環(huán)節(jié)檢測出蛋白殘留的風(fēng)險。
四、AI-CRISPR?技術(shù)優(yōu)勢
1. AI-CRISPR?技術(shù)優(yōu)勢：擁有更高的基因切割效率與同源重組效率，基因編輯效率提升10-20倍。
2. 成熟的技術(shù)平臺：大量成功案例，在超300種細胞中成功實現(xiàn)超數(shù)千例基因編輯；可提供從細胞基因表達調(diào)控、細胞功能驗證及表型分析的全流程服務(wù)。
3. 脫靶效率低：采用RNP遞送，相比于質(zhì)粒或者病毒等基因敲除方法，具有更高的特異性和編輯效率。其能準確靶向目的細胞，提高效率的同時減少非特異的切割；實現(xiàn)Cell pool/純合子交付，快至6周。
4. 應(yīng)用廣泛：AI-CRISPR?基因編輯輕松實現(xiàn)基因 敲除/點突變/敲入；承諾項目失敗全額退款，成功保障安全無憂。
5. 嚴格的質(zhì)量控制體系：進行細菌、支原體等微生物的雙重檢測，確保100%無污染，并充分鑒定基因編輯效果；進行細胞活率檢測，保證交付質(zhì)量。
五、案例分析
| 種屬 | 人 |
|---|---|
| 細胞名稱 | BEAS-2B細胞 |
| 培養(yǎng)體系 | DMEM-H＋10% FBS＋1% P/S |
| 基因型檢測 | 針對gRNA打靶位置及其附近基因組序列進行測序。測序結(jié)果與理論序列一致 |
| 細胞轉(zhuǎn)導(dǎo) | 1350V,20ms,1次；電轉(zhuǎn)體系：10 uL |
| 克隆形成率 | 細胞增殖能力較好 |
| PCR篩選 | 篩選克隆數(shù)量：170； 雜合子數(shù)量：13； 純合子數(shù)量：2 |
| PCR方案1 |
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| 電泳圖數(shù)據(jù)1 | WT：490 bp； 雜合子：490 bp； 純合子：0 bp |
| 電泳圖示例1 |
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| PCR方案2 |
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| 電泳圖數(shù)據(jù)2 | WT：0 bp； 雜合子：~218 bp； 純合子：~218 bp |
| 電泳圖示例2 |
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| 測序結(jié)果 | TAAGTCCGTGGGCTTTGCTTCCTCTTGGCCCTGGGTTTGTGTCCCAG-del-3310bp-TTTGCATGCTGGTCTCGAACTCCTGGGCTCAAGAGATCCTCC |
| 克隆狀態(tài) |
|
文獻解讀：CRISPR基因編輯BEAS-2B細胞系——希望就在呼吸之間
1. BEAS-2B細胞背景
BEAS-2B細胞是從肺癌個體的正常人支氣管上皮病理切片分離出的上皮細胞。這個細胞引種自ATCC CRL-9609，又可被稱為 支氣管上皮細胞。BEAS-2B細胞系最初是通過使用腺病毒12-SV40雜交病毒感染，并通過連續(xù)細胞傳代建立的永生化細胞系，它保留了對血清反應(yīng)進行鱗關(guān)分化的能力，這種能力可用于篩選誘導(dǎo)或影響分化及致癌的化學(xué)或生物制劑，因此 BEAS-2B細胞被認為是研究藥物代謝活化作用和呼吸系統(tǒng)腫瘤以及分子機制理想的細胞模型。
2. BEAS-2B的應(yīng)用
BEAS-2B 細胞在成骨和成脂分化方面與 hMSCs 具有相似的潛力
將細胞分化誘導(dǎo)21天后，用油紅染色分化脂肪細胞中的脂質(zhì)液泡，然后使用茜素紅染色分化骨細胞中的鈣沉積。結(jié)果表明BEAS-2B和在成骨發(fā)生或脂肪發(fā)生方面均顯示出幾乎相同的陽性染色，這說明BEAS-2B 細胞能像hMSC1細胞一樣能在誘導(dǎo)后表現(xiàn)出很強的骨細胞和脂肪細胞分化能力。
BEAS-2B可用于篩選化學(xué)和生物制劑誘導(dǎo)。目前，BEAS-2B已被廣泛用于研究肺癌發(fā)生的細胞和分子機制，其中包括上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在肺癌和肺炎球菌感染中的作用等。此外，BEAS-2B細胞系已被用作體外細胞模型，用于檢測和篩選具有潛在肺毒性或肺部致癌性的各種化學(xué)和生物制劑。
3. 使用AI-CRISPR?在BEAS-2B細胞中實現(xiàn)基因編輯
基因編輯和細胞模型的建立對于推進功能基因組學(xué)、信號通路、新陳代謝、細胞死亡、藥物發(fā)現(xiàn)、藥物反應(yīng)和癌癥研究等領(lǐng)域具有重要的意義。BEAS-2B細胞作為研究藥物代謝活化作用和呼吸系統(tǒng)腫瘤以及分子機制的理想細胞模型，已經(jīng)有許多研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)對其進行編輯以研究癌癥特征、耐藥機制的披露、癌癥治療、細胞死亡研究、功能基因組學(xué)、信號通路、藥物發(fā)現(xiàn)、藥物反應(yīng)和細胞治療等多種具有重要意義的課題。天博克羅地亞官網(wǎng)研發(fā)的AI-CRISPR?（基于CRISPR/Cas9技術(shù)）在DNA雙鏈的切割上比一般的CRISPR/Cas9系統(tǒng)更有效率，不僅可以顯著提高同源重組的效率，還能同時在體內(nèi)外實現(xiàn)高效的基因編輯，對于BEAS-2B細胞的基因編輯實驗有著極大的優(yōu)勢。
圖1 使用AI-CRISPR?在BEAS-2B細胞中基因編輯過程
3.1 AI-CRISPR?基因敲除BEAS-2B細胞系
通過病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或核轉(zhuǎn)移將gRNA和Cas9轉(zhuǎn)移到細胞中，然后通過藥物篩查后，產(chǎn)生單克。鈧昭糶鑰寺〗ü廡蚪醒櫓。具體案例如下：
圖2 BEAS-2B細胞系的敲除策略
P53基因是氡照射致BEAS-2B細胞惡性轉(zhuǎn)化中的重要影響因素。在人正常肺上皮細胞（BEAS-2B）中 敲除P53基因，并對基因敲除后的BEAS-2B細胞和正常BEAS-2B細胞分別進行氡染毒處理。研究人員發(fā)現(xiàn)，BEAS-2B細胞敲除P53基因后氡照射的BEAS-2B細胞更早地出現(xiàn)了惡性轉(zhuǎn)化。相較于BEAS-2B細胞染氡組(2B-Rn)，P53基因敲除的BEAS-2B細胞染氡組(P53 KO-Rn)增殖速度更快（P<0.05），形成克隆的時間更早（P<0.05）， 侵襲力更強（P<0.05），上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因mRNA表達水平變化也更早（P<0.05）。結(jié)果表明，氡照射導(dǎo)致BEAS-2B細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，并且P53在氡氣致肺癌中具有重要作用。
參考：http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201910-45.
3.2 基因敲入或基因點突變BEAS-2B細胞系
BEAS-2B細胞通過電穿孔法與gRNA、Cas9和Donor載體共轉(zhuǎn)染，然后挑單克隆。陽性克隆將通過測序進行驗證。具體案例如下：
圖3 BEAS-2B細胞系的敲入策略
（1）敲入案例
為了研究突變體NRASQ61K在血管再生中的特異性影響，在正常（非腫瘤）人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)中進行了敲入。與野生型(WT)細胞相比，在CAM上生長的NRASQ61K 過表達細胞的特征是血管系統(tǒng)紊亂，并存在若干個出血區(qū)域。為了證實體內(nèi)NRASQ61K的促血管生成作用，在裸鼠身上進行了Matrigel plug試驗，結(jié)果如圖5B中所示，NRASQ61K表達細胞顯示出血管再生明顯增加，呈亮紅色。然而， 野生型細胞中的血管再生可以忽略不計，并且血紅蛋白水平較低。除此之外，研究者還發(fā)現(xiàn)NRASQ61K在體外的表達顯著增加了類毛細管網(wǎng)絡(luò)，如圖5C所示。而腫瘤血管生成的關(guān)鍵所在正是細胞在骨髓上自發(fā)形成毛細血管樣結(jié)構(gòu)，因此，NRASQ61K的表達會在一定程度上促進腫瘤血管的生成。
圖5 將NRASQ61K敲入BEAS-2B細胞
（2）點突變案例
BEAS-2B細胞通過電穿孔法與gRNA、Cas9和Oligo共轉(zhuǎn)染，然后挑單克隆。陽性克隆將通過測序進行驗證。具體案例如下：
圖4 BEAS-2B細胞系的點突變策略
COX-2基因啟動子區(qū)域包含NFκB、AP-1和NFAT結(jié)合位點，它們可以被這些轉(zhuǎn)錄因子識別，進而導(dǎo)致COX-2的轉(zhuǎn)錄。為了確定NFAT是否通過直接結(jié)合COX-2啟動子區(qū)域來調(diào)節(jié)COX-2的表達，研究人員應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)，對COX-2-Luc啟動子區(qū)域的兩個NFAT結(jié)合位點進行了點突變。結(jié)果表明，這種突變導(dǎo)致亞砷酸鹽暴露誘導(dǎo)的COX-2轉(zhuǎn)錄受損。并且研究人員發(fā)現(xiàn)，與COX-2誘導(dǎo)相比，亞砷酸鹽在研究中的NFAT激活達到了更早的峰值。因為亞砷酸鹽的暴露只會導(dǎo)致BEAS-2B細胞中的NFAT的激活，而不是AP-1和NFκB的激活，所以亞砷酸鹽激活NFAT是BEAS-2B細胞中COX-2誘導(dǎo)的原因。
另外為了證實NFAT3 在 BEAS-2B 細胞中亞砷酸鹽誘導(dǎo)的 COX-2 表達中的重要作用，研究人員構(gòu)建并使用了siNFAT3，他們將細胞用10μm NFAT 選擇性抑制劑預(yù)處理，然后暴露于20μm亞砷酸鹽中，研究人員發(fā)現(xiàn)BEAS-2B細胞中siNFAT3的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染導(dǎo)致BEAS-2B細胞中NFAT3蛋白表達的明顯降低(圖. 6 中b)。siNFAT3對NFAT3表達的特異性抑制阻斷了亞砷酸鹽誘導(dǎo)的COX-2轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(圖. 6 中e和h）。
這些結(jié)果表明了，NFAT3是BEAS-2B細胞中亞砷酸鹽誘導(dǎo)COX-2的主要介質(zhì)。
COX-2的主要介質(zhì).jpg)
參考文獻:
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